专题一：RNA干扰时刻（RNAi） 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因抒发的磨练中发现，反义和正义RNA王人阻断了基因的抒发，他们对这个收尾百想不得其解。直到1998年， Andrew Fire的商讨解释，在正义RNA也阻断了基因抒发的磨练中，委果起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因抒发的阻断作用被称为RNA侵犯（RNA interference，RNAi）。随后的商讨中发现，RNAi情状平凡存在于线虫，果蝇快乐风男 勾引，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体行使RNAi来抵抗病毒的感染，阻断转座子的作用。RNAi能高效特异的阻断基因的抒发，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。在小鼠和东谈主的体外培养细胞中行使RNAi时刻也告捷阻断了基因的抒发，齐全了细胞水平的基因敲除。近几年来RNAi的商讨获取了很猛进展，它被《Science》杂志评为2001年的十大科学成立之一。2002年RNAi的商讨又有了新的破碎，发现它在基因抒发调控中施展进攻作用，它也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成立之首。 一. RNAi的机理 　　刻下RNAi的作用机理主如果在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内发扬的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录家具，外源导入的基因。这些开始的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，收尾是病毒被捣毁，转座子的抒发被阻断，外源导入基因抒发被阻断同期，与其同源的细胞基因组中的基因抒发也被阻断。 1、 参与RNAi反映的酶 　　RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反映的Dicer酶是RNA酶Ⅲ眷属的一个成员。Dicer酶平凡存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA谄谀位点。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片段，称为siRNA（short interference RNA），它启动了细胞内的RNAi反映。 　　由于极少的双链RNA就能阻断基因的抒发，何况这种效应不错传递到子代细胞中，商讨者们估计细胞内存在RNAi效应的扩增系统。商讨者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的团员酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反映过程，呈指数级的数量扩增。 2、 RNAi的反映过程 　　双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些卵白形成复合物，Argonaute2是刻下独一已知的参与复合物形成的卵白。此复合物同与siRNA互补的mRNA谄谀，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA手脚引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。收尾mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些重生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个团员酶链式反映，细胞内的siRNA大大增多，显耀增多了对基因抒发的拦截。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA王人能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因抒发的效果光显强于短的双链RNA。 二. 哺乳动物细胞中的RNAi 　　在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi，将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的RNAi机制，并拦截了答复基因的抒发。但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的抒发。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒留神机制被激活。细胞内干扰素产生增多，卵白激酶PKR激活，使转录因子E2F被拦截，非特异的阻断基因的转录，并诱导细胞凋一火。另一方面，RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异的mRNA降解。而未分化的胚胎细胞中，上述留神病毒的机制存在残障，因而双链RNA能特异的阻断基因的抒发。 　　由于大于30个核苷酸的双链RNA非特异的阻断哺乳动物成体细胞中的基因抒发，RNAi在哺乳动物成体细胞中的应用受到截止。但Tuschl等东谈主的商讨职责克服了这一贫困。他们发现，21个核苷酸的双链RNA不祥诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制，同期不会激活细胞内的干扰素。他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA，将它和荧光素酶的抒发质粒用脂质体共转染到NIH3T3，COS-7，Hela S3，293细胞中，答复基因的抒发被拦截了90%。由于答复基因得到的收尾弗成透澈评释细胞内的情况，他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶盘算的双链RNA，这个双链RNA也特异的拦截了laminA/C的抒发，拦截率达到90%以上。 　　根据一条mRNA的不同靶位点不错合成出许多条双链RNA，商讨发现这些双链RNA的作用辞别很大。其中转录肇端位点，编码区的3’结尾为靶点的双链RNA的效果很差。而GC含量低的区域似乎双链RNA的效果好。线虫内的siRNA不错手脚引物，以靶mRNA为模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量扩增siRNA。将siRNA的3’结尾美艳上FITC使它丧失引物的作用，在将其转入哺乳动物细胞内，它拦截靶基因的作用并莫得受到影响。因而商讨者估计，哺乳动物细胞内不存在象线虫那样的依赖于RDRP的RNAi放大机制。在哺乳动物细胞中瞬时转染dsRNA后，dsRNA的作用只看守了三天。而将抒发dsRNA的载体转入哺乳动物细胞后筛选出的平安抒发株中，在转染八周后dsRNA仍能有用的拦截靶基因的抒发。行使载体抒发出的dsRNA为发夹结构，其环状部位的核苷酸的序列和数量对dsRNA的作用王人有影响，商讨者发现9个核苷酸比5个或7个核苷酸的效果好。DsRNA的作用很强，在1nM时就能有用的阻断靶基因的抒发。RNAi还具有很高的特异性。19个核苷酸的dsRNA险些不错透澈拦截基因的抒发，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的拦截作用就散失了，这对dsRNA的应用吊祭常进攻的，这不错幸免dsRNA降解与靶mRNA同眷属的其他的mRNA。 三. 双链RNA的构建 　　双链RNA可先在体外构建好，然后转染细胞。在体外构建双链RNA时，别离在体外转录出正义和反义RNA，再将两者退火，形成双链RNA。体外合成的双链RNA不错用脂质体转入细胞中。但有些细胞脂质体转动效果差，转动到细胞内的双链RNA半衰期短。而先在体外构建能抒发双链RNA的载体，再将载体转动到细胞内在细胞内合成出双链RNA，不但能增多有用转染细胞的种类，而且在恒久平安抒发载体的细胞株中，双链RNA不祥恒久施展阻断基因的作用。 　　在构建双链RNA的抒发载体时，使用RNA多聚酶Ⅲ来指导RNA的合成。这是因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和拆伙序列，而且合成出的RNA不会带有polyA尾。当RNA多聚酶Ⅲ遭受连气儿5个胸腺嘧啶时，它指导的转录就会拆伙，何况转录家具在第二个尿嘧啶处被切下来。U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别， 合成出RNA。ShiYang等东谈主用Bluescript手脚载体，U6手脚启动子，从绿色荧光卵白（GFP）的基因上采选了一个21个核苷酸的片段（片段1），将其插入到Bluescript载体中。然后合成出片段1的反向肖似序列，并在后来加了5个胸腺嘧啶，称为片段2。他们将片段2接到Bluescript载体中片段1的背面，将载体转动到细胞中后，转录出的RNA由于具有回环序列，会形成一个发夹样结构，从而得到了双链RNA。片段背面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会拆伙。而且转录出的RNA形成发夹样结构后，会在3’端形成2个杰出的尿嘧啶，这类似于自然的siRNA，因而成心于双链RNA诱发RNAi。 　　RNA多聚酶Ⅲ还能识别H1-RNA 启动子。在H1-RNA 启动子背面接上能形成发夹样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA。 　　T7也可手脚启动子合成dsRNA。将PCR家具用NotI酶切后自身集结，回收正向片段和反向片段集结形成的具有回转肖似序列的片段，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了不错抒发dsRNA的载体。用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA。在后一种情况下，还须将能抒发T7RNA多聚酶的载体也沿途转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶。 　　双链RNA只可片时拦截哺乳动物细胞的基因抒发。而具有发夹结构的双链RNA不祥增多阻断基因抒发的时期。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，C2C12细胞中，用长链具有发夹结构的双链RNA有用的阻断了答复基因的抒发，在平安抒发具有发夹结构的双链RNA的细胞株中，答复基因的抒发被恒久的阻断了。 　　腺病毒是体内转基因的常用载体。Xia HaiBin等用腺病毒作念载体，全国约炮在体内和体外抒发dsRNA，并告捷的阻断了基因的抒发，从而齐全了成体动物的基因敲处。 四. RNAi的应用 1. 高通量的商讨基因功能 　　在后基因组期间，需要大边界高通量的商讨基因的功能，由于RNAi能高效特异的阻断基因的抒发，因而RNAi成为商讨基因功能的很好的用具。商讨者将线虫三号染色体上2232个基因对应的dsRNA合成出来，并打针到线虫性腺内，然后不雅察子代细胞分裂时出现的颠倒表型，收尾发现了133个基因与细胞分裂颠倒关联。其中104个基因曩昔莫得发现存这种功能。在另外一项商讨中，线虫一号染色体上的2416个基因对应的dsRNA被构建到细菌文库中，然后将细菌喂给线虫，不雅察样式学的颠倒，颠倒的迷惑，性别比例的变化，不孕的情况，收尾将于这些表型关联的基因从70个增多到178个。 2. 基因敲除 　　在线虫的体表里磨练中，RNAi王人能达到基因敲除的收尾，从而成为商讨这些基因功能的深重用具。关于哺乳动物，RNAi能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果，关于一些敲除后小鼠在胚胎时就会归天的基因，不错在体外培养的细胞中行使RNAi时刻商讨它的功能。由于RNAi能高效特异的阻断基因的抒发，它成为商讨信号传导通路的深重用具。在线虫体内，胰岛素和受体谄谀后不错活化DSOR1，它是MEK的类似物，DSOR1活化后不错激活ERKA，它是ERK的类似物。用以DSOR1为靶盘算的dsRNA不错阻断DSOR1的抒发，诚然总的ERKA的抒发不受影响，但由于DSOR1的抒发被拦截，因而胰岛素刺激后ERKA弗成活化。RNAi还被用来商讨在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的抒发，来商讨他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着要道作用。 3. 基因诊治 　　刻下拦截基因抒发常汲取反义时刻或转入莫得功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因抒发的拦截王人不如RNAi高效特异合手久。手脚基因诊治的用具，RNAi既高效特异，又便捷易行。RNAi在某个基因抒发颠倒增高引起的疾病中会相配有用，如病毒感染，肿瘤等。CDK-2是调控细胞周期的一个要道基因，用以CDK-2位靶盘算的dsRNA能阻断99.7%的细胞中CDK-2的抒发，而在对照中唯有0.2%的细胞中CDK-2基因的抒发镌汰[10]。因而，以CDK-2位靶盘算的dsRNA能诊治细胞颠倒增殖关系的疾病，如肿瘤等。DsRNA还不错抗病毒诊治。商讨者们将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的抒发被显耀拦截。CD4基因编码细胞名义HIV病毒的受体，用针对CD4的dsRNA能将细胞名义HIV病毒的受体抒发减少75%，从而招架HIV病毒的感染。 4. 基因抒发调控 　　本年商讨者发现RNAi在Epigenetics中施展进攻作用。Epigenetics是指至少一代的基因抒发的改革，而基因的编码莫得改革。本年商讨者发现，epigenetics调控的一种类型是染色体的改革。通过改革染色体的时局（更紧或是更松），不祥决定那一个基因抒发。但什么促进了染色体时局的改革曩昔并不明晰。本年商讨者发现，siRNA在染色体时局的改革中起着相配进攻的作用。这么RNAi能遥远的关闭基因的抒发，而不单是是短期的拦截它。通过在发育过程中关闭或洞开基因的抒发，siRNA可能指导着细胞的定向分化。RNAi已被证明能引导植物干细胞的分化，因而商讨者以为RNAi也可能参与指导东谈主的干细胞的分化。由于RNAi在基因抒发调控中施展进攻的作用，对RNAi狭窄的干扰就可能导致肿瘤的发生。 　　刻下RNAi在非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用还是获取了许多进攻的效果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段。在哺乳动物细胞中，RNAi并弗成透澈阻断基因的抒发，极端是抒发颠倒高的基因。Tuschl等东谈主的商讨职责中，有三个基因被拦截了90%，但有一个基因莫得被拦截，这等于一个抒发很高的基因。另外，运送体系一直是体内基因诊治的瓶颈，若何将双链RNA高效特异的转入体内仍是一个难题。刻下已能用腺病毒手脚载体在体内齐全RNAi，但仍需要寻找更为安全有用的载体。

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